試薬

• 70%グルタルアルデヒド
• 10%パラフォルムアルデヒド（当日作成する。）
  • 粉末試薬を蒸留水に溶かす。
  • 加熱し、NaOHを加え溶解させる。
  • 冷やす。
• 0.2Mカコジル酸バッファー(pH 7.4)　ヒ素含有　取扱い注意
• 洗浄液
  • 0.1Mカコジル酸バッファー(pH 7.4)　ヒ素含有　取扱い注意
• 前固定液
  • 0.1Mカコジル酸バッファー(pH 7.4)　ヒ素含有　取扱い注意
  • 4%パラホルムアルデヒド
  • 0.5%グルタルアルデヒド
• エタノールシリーズ（50, 70, 80, 90, 95, 100%）
  • 100%エタノールにはモレキュラーシーブを入れておく。
• プロピレンオキサイド
• Spurr樹脂
  • ERL 4206    10 g      樹脂はスポイトで量り取る
  • DER 736     6 g
  • NSA             26 g      ここまでを混ぜてから、次にS-1を加える。
  • DMAE (S-1) 0.4 g
• LR White樹脂
• TIブルー
  • TIブルー：蒸留水（1：1）
• クエン酸鉛
  • 煮沸した水にとかしシリンジ中に密閉したもの

固定

1. 試料を3mm程度にカミソリで細切する。
2. 試料を前固定液に加える。（氷中）
3. 2-3分間脱気する。
4. 氷中で2時間インキュベートする。
5. 洗浄液で30分間3回洗浄する。（氷中）
6. 蒸留水で5分間3回洗浄する。（氷中）
7. 氷上で試料を0.5mm程度にカミソリで細切する。

脱水

1. 20, 50, 70, 80, 90, 95%エタノールで20分づつ脱水する。（冷蔵庫）
2. 100%エタノールで20分づつ3回脱水する。（冷蔵庫）
3. 100%エタノールで一晩脱水する。（冷凍庫）
4. 冷蔵庫に移す。
5. 室温に戻す。

樹脂浸透

1. 20% LR White（エタノール）で30分浸透させる。
2. 40% LR White（エタノール）で30分浸透させる。
3. 60% LR White（エタノール）で30分浸透させる。
4. 80% LR White（エタノール）で30分浸透させる。
5. 100% LR Whiteで2回樹脂を入れ替える（残った液を綿棒でよく拭き取る）。
6. 100% LR Whiteで一晩浸透させる。
7. 100% LR Whiteで3回で3時間浸透させる。
8. 100% LR Whiteの入ったゼラチンカプセルに移す。
9. 55℃で24時間重合させる。

または

1. プロピレンオキサイドで5分間2回置換する。
2. Spurr樹脂：プロピレンオキサイド（1：2）で1時間浸透させる。
3. Spurr樹脂：プロピレンオキサイド（1：1）で1時間浸透させる。
4. Spurr樹脂：プロピレンオキサイド（2：1）で1時間浸透させる。
5. Spurr樹脂：プロピレンオキサイド（3：1）で1時間浸透させる。
6. Spurr樹脂：プロピレンオキサイド（4：1）で1時間浸透させる。
7. Sppur樹脂で1時間以上浸透させる。
8. Sppur樹脂で一晩浸透させる。
9. Sppur樹脂で3回で3時間浸透させる。
10. 70℃で8－12時間重合させる。

トリミング・セクショニング

1. トリミングする。
2. 200 nmのセクションを作成し、シランコートスライドグラスに張り付ける。（光顕）
3. 80 nmのセクションを作成し、Niグリッドにのせる。（電顕）

免疫染色

1. 10% H₂O₂/メタノールで10分間エッチングする。（Spurr樹脂の時）
2. BSA/TBSで10分間ブロッキングする。
3. 20 µg/ml PPBD – 10 µg/mlanti Xpress antibodyin TBS-BSAで2時間反応する。
4. TBS+0.05% Triton X-100で洗浄する。
5. TBSで洗浄する。
6. 1/5000 Alexa488標識anti-mouse IgG抗体in TBS-BSAで1時間反応する。（蛍光）
7. 1/20 10 nm金コロイド標識anti-mouse IgG抗体in TBS-BSAで1時間反応する。（電顕）
8. TBS+0.05% Triton X-100で洗浄する。
9. TBSで洗浄する。
10. 蒸留水で洗浄する。

電子染色

1. Tiブルーで染色する。
2. 蒸留水で３回洗浄する。
3. クエン酸鉛で染色する。
4. 0.1N NaOHで1回、蒸留水で2回洗浄する。
5. 乾燥させる。