pUB-GWS-GFPまたはpUB-GWS-Hygを使用したミヤコグサRNAi用コンストラクト作製
Maekawa, T., Kusakabe, M., Shimoda, Y., Sato, S., Tabata, S., Murooka, Y.,
and Hayashi, M. (2008). Polyubiquitin promoter-based binary vectors for
overexpression and gene silencing in Lotus japonicus. Molecular Plant-Microbe
Interactions 21, 375-382.
※ベクターは
ナショナルバイオリソースから入手可能
- ターゲット領域（数百bp）をPCR増幅し、pENTR/D-TOPOベクター（invitrogen）にクローニングする。（クローニングー＞Gatewayを参照）
- シーケンスし塩基配列を確認する。
- pENTR/D-TOPOをHpaIで切断した後、LR反応でターゲット領域をpUB-GWS-GFPまたはpUB-GWS-Hygに組み込む。
- カナマイシン（pUB-GWS-GFP）またはハイグロマイシン（pUB-GWS-Hyg）を含むLB寒天培地で選択する。
- gene specific forward primer / WRKY-fプライマーセットを用いてコロニーPCRを行う（約300bp +
ターゲット領域の長さ）。
- プラスミドを精製し、以下のプライマーセットでPCRを行いコンストラクトが正しくできているか確認する。
プライマーセット
- WRKY-f / WRKY-r 約250bp
- gene specific forward primer / WRKY-f 約300bp + ターゲット領域の長さ
- gene specific forward primer / WRKY-r 約300bp + ターゲット領域の長さ
- pUBi-r / gene specific reverse primer 約1kbp + ターゲット領域の長さ
- NosT-r / gene specific reverse primer 約300bp + ターゲット領域の長さ
プライマー配列
- WRKY-f GAGAAGCTAGAACCTGCAAA
- WRKY-r TCTGCTAACGTAAGCCTCTC
- pUBi-r CCATTCTGGAAAACCAAGGA
- NosT-r GATCTAGTAACATAGATGACA