コンピテントセル作成

1. Agrobacteriumを一晩培養する。(2ml YEP, 28℃)
2. 培養液を50mlのYEP（250ml flask）に加える。
3. 28℃、3-4時間培養(Up to OD₅₅₀= 0.35-0.65、通常0.5)
4. 10分以上氷中で静置する。
5. 遠心、3500rpm、15分、4℃
6. 上清を除き、1mlの滅菌済み20mM CaCl₂(on ice)に懸濁
7. 100µlづつマイクロチューブに分注し、液体窒素で凍結後、-80℃保存

トランスフォーメーション

1. コンピテントセルを室温でとかし、15mlファルコンチューブに移す。
2. 1µlのplasmid DNA (約1µg)を加える。（約1µgになるよう容量を多めに加えても構わない）
3. 液体窒素で凍結させる。
4. 37℃で5分間インキュベートする。
5. ただちに1mlYEPを加える。
6. ゆっくり28℃で3時間振とう培養する。
7. 1.5mlのマイクロチューブに移す。
8. 遠心、10000rpm、60秒、4℃
9. 100µlの培地を残し上清をすて、再度懸濁する。
10. YEP寒天（1%）培地(+1/2濃度の抗生物質1種類)に全量スプレッドする。
11. 28℃で2日間培養する。
12. KOD FX（20µlスケール）を用いてコロニーPCRを行う。
13. YEP寒天（1%）培地(+1/2濃度の抗生物質2種類)で増殖を確認する。

• Agrobacterium tumefacienceLBA4404：1/2 Str、1/2 Hm (or Km、バイナリーベクターの種類による)
• Agrobacterium rhizogenesLBA1334：1/2 Spe、1/2 Hm (or Km、バイナリーベクターの種類による)
• Sigma社のハイグロマイシンは凍結すると失活するので注意

YEP

YEP寒天培地