試薬 reagents

                             KH2PO4は110℃で一晩乾燥後デシケータに保存  incubate KH2PO4 at 110℃ overnight and reserve it in a desiccator
                             メスフラスコとホールピペットを使用 use volumetric flasks and whole pipettes

粉砕 crush

  1. 乾燥後デシケータに保存した試料を用いる。use dry materials
  2. 試料が極少量の場合（< 1mg）はそのまま分解に用いる。use whole materials if the amount of the materials is less than 1 mg
  3. 試料が少量の場合（数mg）は乳鉢で粉砕する。crush the materials using a mortar  if the amount of the materials is several mg
  4. 試料が数gの場合は粉砕機で粉砕する。（紛体が飛び散るのでドラフトで）cruch the materials using a blender  if amount of the materials is several g
  5. 二重のビニール袋を用意し、ラベルを書いた紙と試料を入れ輪ゴムで口を閉じる。preserve the powder in double plastic bags and label the sample ID

湿式灰化 wet ashing

  1. 1/16に切っておいた薬包紙の風袋を取る（Zeroにする）。measure a tare (1/16-cut powder paper) and set zero
  2. 粉砕試料5-10mgを1/16薬包紙に包み、包んだ後に重量（A）を記録する。（静電気に注意する。アルミ箔で静電気除去）take 5-10 mg powderd samples in the paper, wrap them and weight it
  3. 耐熱試験管（Pyrex）に入れる。add the wrapped sample in a test tube made of Pyrex
  4. 薬包紙のみも2サンプル用意する。prepare two control samples (only powder paper)
  5. ヒートブロックを予め200℃に加熱しておく。（ドラフトで）preheat blocks at 200℃ in a fume hoods
  6. 5%硫酸を400µl加える。（専用のマイクロピペットを使用）add 400 µl of 5% sulfate in each test tube using a dedicated pipette
  7. 過酸化水素水を100µl加える。add 100 µl of conc. hydrogen peroxide in the test tube using the dedicated pipette
  8. 200℃で加熱する。add the test tube in the hole of the blocks and keep at 200℃
  9. 過酸化水素水を400µl加える。5回以上加える。add 400 µl of conc. hydrogen peroxide in the test tube more than 5 times
  10. 2時間以上加熱する。（試験管の位置を時々入れ替える）keep heating over 2 hours and sometimes change the position of test tubes
  11. 壁面に付いた過酸化水素水を蒸留水で数回洗い落とす。（過酸化水素水が残っていると測定できない。）wash out hydrogen peroxide attached to the wall of the test tubes with DW several times
  12. さらに約30分加熱する。keep heating for 30 min
  13. 放冷する。（一晩放冷した方が発色時に黄色になり難い）cool down
  14. マイクロチューブの風袋をとる。weight empty microtubes
  15. 蒸留水を500µl加え、よく撹拌する。add 500 µl of DW into each test tube and vortex
  16. スポイトで吸い取りラベルしたマイクロチューブに移す。transfer the solution to a microtube using a Pasteur pipette
  17. もう一度蒸留水を500µl加え、スポイトを用いて壁面についた溶液を洗い落とす。add 500 µl of DW into each test tube again and vortex
  18. スポイトでマイクロチューブに移す。このときの溶液の重量（B）を記録する。transfer the solution to the microtube

発色 

  1. 発色液を作製する。（約50サンプル分）make reagent (for 50 samples)
2.5M硫酸  2.5 M sulfate                                     6 ml
モリブデン酸アンモニウム   ammonoum molybdate solution    1.8 ml
酒石酸アンチモニルカリウム  antimony potassium tartrate solution   0.6 ml
アスコルビン酸   ascorbate                        0.063 g
蒸留水    DW                                     44.1 ml

  1. 検量線用のサンプルを調整する。（1.5 mlマイクロチューブを使用）prepare standard solution in 1.5 ml microtubes

                                             0     5    10    15    20    25    30 mg / l
50 mg PO4/ L標準液  standard     0   10    20    30    40    50    60 µl
蒸留水  DW                          100   90    80    70    60    50    40 µl
 
  1. サンプルと発色液を混合する。（1.5 mlマイクロチューブを使用）mix regent mixture and sample solution in 1.5 ml microtubes
発色液  reagent mixture       900  µl
試料溶液  sample solution   100  µl
 
植物体中のリン濃度が高い場合（菌根植物など）は２～３のステップを以下のように変更する。If conc. of P in the materials is very high (like mycorrhizal plants), modify the procedure of step 2-3 as below

  1. 検量線用のサンプルを調整する。（1.5 mlマイクロチューブを使用）prepare standard solution in 1.5 ml microtubes

                                              0     20     50    100    150    200  mg / l
200 mg PO4/ L標準液  standard     0       2       5       10      15       20  µl
蒸留水  DW                              20    18     15       10        5         0   µl
 
  1. サンプルと発色液を混合する。（1.5 mlマイクロチューブを使用）mix regent mixture and sample solution in 1.5 ml microtubes
発色液  reagent mixture       980  µl
試料溶液 sample solution      20  µl
 
 

吸光度測定 measurement of absorbance

  1. 発色液添加後15分間放置する。incubate for 15 min
  2. 710nmの吸光度（C）を測定する。セミマイクロキュベットを使用。measure absorbance (C) at 710 nm using a spectrophotometer. use a semimicro cuvette

         If the sample solution is yellow, it may contain remaining hydrogen peroxide, which prevent the measurement.

        If absourbance is over 0.8, dilute the sample solution.

計算法 culculation

  1. Excellで検量線を作成する。吸光度をx軸に、濃度をy軸にとり、直線回帰する。make standard curve using Excell. x: absorbance, y: conc. of phosphate
  2. 以下の計算式で植物体中のリン含量を求める。calculate P content as below

分解産物のリン酸濃度 conc. of phosphate in ashing product（D, mg PO4/ L）：検量線の回帰式のxに吸光度（C）を代入 substitute C for x of the regression formula

分解産物のリン酸含有量 content of phosphate in ahsing product（E, mg PO4）：（D）に分解産物の容量（B）/ 1000 (L)をかける multiply D by volume of the sample solution (B) and divide it by 1000

植物体リン酸含有量 content of phosphate in plant（F, mg PO4/ mg）：（E）から薬包紙リン酸含量を引き（A）で割る subtract E by P content in a powder paper and divide it by A 

植物体リン含有率（%）=（F）に30.97 / 94.97をかけ、さらに百分率を算出  P content in plant (%) = F x 30.97 / 94.97x 100

分子量 molecular weight

P: 30.97、O: 16.00、PO4: 94.97、KH2PO4: 136.09

 

参考図書 reference

土壌環境分析法編集委員会編「土壌環境分析法」博友社．東京．（1997）．p. 268-269.