Cerium塩法

1. 根を5-10 mmに切断する。
2. 切断根を前固定液に浸す。
3. 2-3分間脱気する。
4. 氷中で2時間インキュベートする。
5. 洗浄液で30分間、2回洗浄する。（氷中）
6. 洗浄液中で根を0.5-1 mmにカミソリで細切する。（氷上）
7. pre-incubation buffer中で37℃、1時間回転させながらインキュベートする。
8. reaction buffer中で37℃、30分間回転させながらインキュベートする。
9. pre-incubation buffer中で15分間回転させながら室温でインキュベートする。
10. 100 mM acetate buffer中で15分間回転させながら室温でインキュベートする。
11. 後固定液に加えて氷中で2時間インキュベートする。
12. 純水で5分間、3回洗浄する。（氷中）
13. 20, 50, 70, 90, 95%エタノールで20分間づつ４℃で回転させながら脱水する。
14. 100%エタノールで20分間、4℃で3回脱水する。
15. -20℃で一晩放置する。
16. 4℃で放置する。
17. 室温で放置する。
18. プロピレンオキサイドで5分間、2回室温で置換する。
19. Spurr：プロピレンオキサイド＝1:2を1時間浸漬させる。
20. Spurr：プロピレンオキサイド＝1:1を1時間浸漬させる。
21. Spurr：プロピレンオキサイド＝2:1を1時間浸漬させる。
22. Spurr：プロピレンオキサイド＝3:1を1時間浸漬させる。
23. Spurr：プロピレンオキサイド＝4:1を1時間浸漬させる。
24. 100% Spurrを1時間以上浸漬させる。
25. 100% Spurrを一晩浸漬させる。
26. Spurrで包埋する。
27. 70℃で8-12時間加熱し重合させる。

コントロール区

１．基質なし：pre-incubation buffer --> reaction buffer A --> preincubation buffer

２．セリウムなし：pre-incubation buffer B --> reaction buffer B --> preincubation buffer B

試薬

前固定液

後固定液

洗浄液

50 mM PIPES pH 7.0

pre-incubation buffer

pre-incubation buffer B

0.1 M acetate buffer pH 5.0

reaction buffer

reaction buffer A

reaction buffer B

100 mM acetate buffer

100 mM acetate buffer pH 5.0

20 mM CeCl3

10 mM beta-glycerophosphate