Lotus Base


DNA抽出

1. 各植物個体にナンバリングする。
2. 小葉3枚を2 mlマイクロチューブに入れる。
3. マイクロチューブに金属クラッシャーを加える。
4. 冷DNA抽出バッファーを0.5 ml加える。
5. ビーズクラッシャーµT-12で30秒間×2破砕する。
6. 0.2 mlの破砕液を新しい1.5 mlマイクロチューブに移す。
7. 0.5 mlの100%エタノールを加え、混和する。
8. 12,000 rpmで5分間、室温で遠心する。
9. 上清をアスピレーターで吸い取る。極力エタノールを除く。
10. 0.5 mlの70%エタノールを加え、混和し8,9を繰り返す。
11. 100 µlのTEを加えDNAを溶解する。
12. MT-360にかけ（1-2分間）DNAをよく溶解する。
13. -20℃で保存する。 

 PCR増幅

1. PCR反応液を用意する。 

       DW                                   3 µl
       2x KOD FX Neo Buffer      10 µl
       2 mM dNTP                       4 µl
       specific primer f (10 µM)       0.6 µl
       specific primer r (10 µM)       0.6 µl
       lore1 5' out (10 µM)              0.6 µl
       template DNA                       0.8 µl
       KOD FX Neo                         0.4 µl 

2. PCR反応を行う。 

       94℃   2 min
       98℃   10 s     ┐
       60℃   30 s     │ 30 cycles
       68℃     1 min ┘
        4℃   hold 

9. 電気泳動を行う（1.2%アガロース）。

LORE1 5' out: 5'-ACCTTGTTGCTTCAGCCATGG-3'